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博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的自動(dòng)分液系統(tǒng)是一款針對(duì)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)開發(fā)的智能化液體處理設(shè)備，集成了高精度注射泵、智能定位系統(tǒng)及個(gè)性化軟件控制模塊，可實(shí)現(xiàn)多種規(guī)格培養(yǎng)板的自動(dòng)化分液操作。本研究旨在系統(tǒng)驗(yàn)證該自動(dòng)分液系統(tǒng)在高通量細(xì)胞鋪板中的應(yīng)用效果，通過與傳統(tǒng)手動(dòng)鋪板方法對(duì)比，從細(xì)胞密度均勻性、細(xì)胞活力、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性及操作效率等方面評(píng)估其效能，為該系統(tǒng)在生命科學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞系：人肝癌細(xì)胞HepG2、小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3；培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗；培養(yǎng)耗材：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、384孔細(xì)胞培養(yǎng)板；試劑：0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、PBS緩沖液、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8；實(shí)驗(yàn)設(shè)備：博清生物自動(dòng)分液系統(tǒng)、CO?培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀、全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、細(xì)胞制備

將HepG2細(xì)胞和NIH/3T3細(xì)胞分別接種于T75培養(yǎng)瓶中，加入10 mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至匯合度達(dá)80%~90%。棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌2次，加入2mL胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃孵育2~3 min至細(xì)胞脫落。加入完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打形成單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾去除細(xì)胞團(tuán)塊。使用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?cells/mL和5×10?cells/mL，分別用于96孔板和384孔板鋪板實(shí)驗(yàn)。

2、分組與鋪板操作

實(shí)驗(yàn)分為自動(dòng)分液組（博清生物自動(dòng)分液系統(tǒng)）和手動(dòng)操作組（對(duì)照組），每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)平行實(shí)驗(yàn)包含3塊相同規(guī)格培養(yǎng)板。

自動(dòng)分液組：將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液置于博清生物自動(dòng)分液系統(tǒng)的樣品架上，根據(jù)培養(yǎng)板規(guī)格（96孔/384孔）在系統(tǒng)軟件中設(shè)置分液參數(shù)（96孔板每孔加液量100μL，384孔板每孔加液量20μL），啟動(dòng)自動(dòng)分液程序，完成細(xì)胞鋪板操作。

手動(dòng)操作組：由經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)人員使用12道移液槍，根據(jù)上述相同的加液量，逐孔完成細(xì)胞懸液的手動(dòng)分液接種。

完成鋪板后，將所有培養(yǎng)板置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h。

3、細(xì)胞密度均勻性檢測(cè)

培養(yǎng)24h后，取出培養(yǎng)板，在倒置顯微鏡下選取每塊板的4個(gè)角落孔、4個(gè)邊緣孔及中心4個(gè)孔（共12個(gè)孔）進(jìn)行觀察，每個(gè)孔隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照。使用ImageJ軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算每孔細(xì)胞密度及組內(nèi)變異系數(shù)（CV，CV=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值×100%），以此評(píng)估細(xì)胞鋪板的均勻性。

4、細(xì)胞活力檢測(cè)

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。培養(yǎng)24h后，棄去各孔培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8試劑的完全培養(yǎng)基（96孔板每孔100μL，384孔板每孔20μL），置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中孵育2h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處的吸光度（OD值），細(xì)胞活力以自動(dòng)分液組與手動(dòng)操作組OD值的比值表示（手動(dòng)操作組活力設(shè)為100%）。

5、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性評(píng)估

選取HepG2細(xì)胞進(jìn)行96孔板鋪板實(shí)驗(yàn)，自動(dòng)分液組和手動(dòng)操作組均設(shè)置6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)批次，每個(gè)批次重復(fù)3塊培養(yǎng)板。計(jì)算每個(gè)批次的平均細(xì)胞密度及批次間變異系數(shù)，評(píng)估兩組實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。

6、操作效率統(tǒng)計(jì)

分別記錄自動(dòng)分液組和手動(dòng)操作組完成10塊96孔板和10塊384孔板鋪板所需的總時(shí)間（包括設(shè)備調(diào)試、樣品準(zhǔn)備及分液操作時(shí)間），計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)的鋪板數(shù)量，評(píng)估兩組的操作效率。

二、結(jié)果

（一）博清生物自動(dòng)分液系統(tǒng)提升細(xì)胞鋪板密度均勻性

不同細(xì)胞系在96孔和384孔板中的鋪板密度均勻性結(jié)果。對(duì)于HepG2細(xì)胞，自動(dòng)分液組在96孔板中的細(xì)胞密度CV值為6.2%±0.8%，顯著低于手動(dòng)操作組的13.2%±1.5%（P<0.01）；在384孔板中的CV值為7.5%±1.1%，同樣顯著低于手動(dòng)操作組的18.3%±2.1%（P<0.01）。對(duì)于NIH/3T3細(xì)胞，自動(dòng)分液組在96孔板和384孔板中的細(xì)胞密度CV值分別為5.8%±0.7%和7.2%±1.0%，均顯著低于手動(dòng)操作組的12.5%±1.3%和17.8%±1.9%（P<0.01）。倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，自動(dòng)分液組各孔細(xì)胞分布均勻，無明顯聚集或稀疏區(qū)域，而手動(dòng)操作組部分邊緣孔和角落孔存在細(xì)胞密度差異。上述結(jié)果表明，博清生物自動(dòng)分液系統(tǒng)可顯著提升高通量細(xì)胞鋪板的密度均勻性。

（二）博清生物自動(dòng)分液系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，自動(dòng)分液組HepG2細(xì)胞和NIH/3T3細(xì)胞的活力分別為92.5%±3.2%和93.1%±2.8%，手動(dòng)操作組細(xì)胞活力分別為100%±0%和100%±0%，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明博清生物自動(dòng)分液系統(tǒng)的分液過程溫和，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，可保持細(xì)胞的正常生理活性，滿足后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的需求。

（三）博清生物自動(dòng)分液系統(tǒng)顯著提升實(shí)驗(yàn)重復(fù)性

HepG2細(xì)胞96孔板鋪板的批次間重復(fù)性結(jié)果顯示，自動(dòng)分液組6個(gè)實(shí)驗(yàn)批次的平均細(xì)胞密度為（1.02±0.03）×10?cells/孔，批次間CV值為2.9%；而手動(dòng)操作組6個(gè)實(shí)驗(yàn)批次的平均細(xì)胞密度為（1.05±0.08）×10?cells/孔，批次間CV值為7.6%。自動(dòng)分液組的批次間變異系數(shù)顯著低于手動(dòng)操作組（P<0.01），表明該系統(tǒng)可有效降低實(shí)驗(yàn)過程中的人為誤差，提升高通量細(xì)胞鋪板實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和可靠性。

（四）博清生物自動(dòng)分液系統(tǒng)大幅提高操作效率

操作效率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，完成10塊96孔板鋪板時(shí)，自動(dòng)分液組所需時(shí)間為25±3min，手動(dòng)操作組所需時(shí)間為85±5min，自動(dòng)分液組操作效率較手動(dòng)操作組提高3.4倍；完成10塊384孔板鋪板時(shí)，自動(dòng)分液組所需時(shí)間為32±4min，手動(dòng)操作組所需時(shí)間為160±8min，自動(dòng)分液組操作效率較手動(dòng)操作組提高5.0倍。此外，自動(dòng)分液系統(tǒng)在操作過程中無需實(shí)驗(yàn)人員持續(xù)值守，可同時(shí)處理多個(gè)樣品，進(jìn)一步節(jié)省了人力成本。

三、討論

高通量細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的核心技術(shù)之一，而細(xì)胞鋪板作為實(shí)驗(yàn)的起始步驟，其質(zhì)量直接決定了后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。傳統(tǒng)手動(dòng)鋪板方法受操作人員主觀因素影響較大，難以實(shí)現(xiàn)高通量、高精度的細(xì)胞接種，已成為制約大規(guī)?？蒲袑?shí)驗(yàn)開展的瓶頸。本研究針對(duì)這一問題，系統(tǒng)評(píng)估了博清生物自動(dòng)分液系統(tǒng)在高通量細(xì)胞鋪板中的應(yīng)用效能，結(jié)果表明該系統(tǒng)在多個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)上均表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。

在細(xì)胞密度均勻性方面，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的自動(dòng)分液系統(tǒng)采用高精度注射泵和智能定位技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)每孔液體體積的精準(zhǔn)控制，有效避免了手動(dòng)移液過程中出現(xiàn)的滴液、掛壁等問題，使得細(xì)胞在培養(yǎng)板中均勻分布。無論是96孔板還是384孔板，無論是不同類型的細(xì)胞系，該系統(tǒng)均能顯著降低細(xì)胞密度的變異系數(shù)，這與現(xiàn)有研究中自動(dòng)化液體處理設(shè)備的優(yōu)勢(shì)一致。均勻的細(xì)胞分布可確保每孔細(xì)胞所處的微環(huán)境一致，為后續(xù)的藥物篩選、基因功能分析等實(shí)驗(yàn)提供標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞模型，減少實(shí)驗(yàn)誤差。

細(xì)胞活力是評(píng)估細(xì)胞鋪板質(zhì)量的另一關(guān)鍵指標(biāo)，若分液過程中細(xì)胞受到過度機(jī)械損傷，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究中，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示自動(dòng)分液組與手動(dòng)操作組的細(xì)胞活力無顯著差異，表明博清生物自動(dòng)分液系統(tǒng)的液路設(shè)計(jì)和分液速度控制合理，可在實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)分液的同時(shí)，最大限度地保護(hù)細(xì)胞的完整性和生理活性。這一特性對(duì)于敏感細(xì)胞系的高通量實(shí)驗(yàn)尤為重要。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)性是科研實(shí)驗(yàn)的核心要求之一，尤其是在藥物篩選等需要大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)的研究中，良好的重復(fù)性可有效減少實(shí)驗(yàn)成本，提高研究效率。本研究中，博清生物自動(dòng)分液系統(tǒng)的批次間變異系數(shù)僅為2.9%，顯著低于手動(dòng)操作組的7.6%，這得益于該系統(tǒng)的自動(dòng)化控制功能，可有效消除不同操作人員、不同操作時(shí)間之間的人為誤差。此外，該系統(tǒng)的軟件模塊支持實(shí)驗(yàn)參數(shù)的保存和調(diào)用，便于實(shí)驗(yàn)流程的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，進(jìn)一步提升了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

在操作效率方面，博清生物自動(dòng)分液系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)尤為突出。對(duì)于384孔板這類高通量培養(yǎng)板，手動(dòng)鋪板需要操作人員逐孔精準(zhǔn)分液，耗時(shí)費(fèi)力且易疲勞，而自動(dòng)分液系統(tǒng)可在短時(shí)間內(nèi)完成大量培養(yǎng)板的處理，且無需人員持續(xù)值守。這一特性不僅提高了實(shí)驗(yàn)效率，還減少了操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度，使其能夠?qū)⒏嗑ν度氲綄?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析中。此外，該系統(tǒng)還支持多種規(guī)格培養(yǎng)板和不同體積液體的分液操作，具有良好的兼容性和靈活性，可滿足不同科研實(shí)驗(yàn)的需求。

當(dāng)然，本研究也存在一定的局限性，例如僅評(píng)估了兩種常見細(xì)胞系在96孔和384孔板中的鋪板效果，未來可進(jìn)一步拓展到其他細(xì)胞類型（如原代細(xì)胞、干細(xì)胞）和更高通量的培養(yǎng)板。同時(shí)，可結(jié)合具體的科研應(yīng)用場(chǎng)景（如藥物高通量篩選、基因編輯文庫篩選），進(jìn)一步驗(yàn)證該系統(tǒng)在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值。

本研究系統(tǒng)驗(yàn)證了博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的自動(dòng)分液系統(tǒng)在高通量細(xì)胞鋪板中的應(yīng)用效能，結(jié)果表明該系統(tǒng)可顯著提升細(xì)胞鋪板的密度均勻性和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，保持較高的細(xì)胞活力，同時(shí)大幅提高操作效率，有效解決了傳統(tǒng)手動(dòng)鋪板方法存在的諸多問題。該系統(tǒng)操作簡便、穩(wěn)定性好、兼容性強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于藥物篩選、基因編輯、細(xì)胞信號(hào)通路分析等多種生命科學(xué)研究領(lǐng)域，為大規(guī)模、高精度的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供了可靠的技術(shù)支撐，具有重要的科研應(yīng)用價(jià)值和推廣前景。