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移液器作為實(shí)驗(yàn)室核心移液工具，其性能參數(shù)（如精度、重復(fù)性、量程適配性）與操作體驗(yàn)（如活塞阻力、吸液穩(wěn)定性）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。傳統(tǒng)移液器在微量移液（≤10μL）時(shí)易出現(xiàn)液體殘留、移液偏差較大等問(wèn)題，尤其在單細(xì)胞分離等對(duì)操作精準(zhǔn)度要求極高的場(chǎng)景中，常導(dǎo)致目標(biāo)細(xì)胞丟失或非目標(biāo)細(xì)胞污染。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的單道移液器針對(duì)微量操作場(chǎng)景優(yōu)化設(shè)計(jì)，采用高精度活塞與防腐蝕密封結(jié)構(gòu)，搭載自適應(yīng)量程校準(zhǔn)技術(shù)，具備更優(yōu)的移液精度和重復(fù)性。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1、核心儀器：博清生物單道移液器；流式細(xì)胞分選儀；微量核酸提取試劑盒；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；生物分析儀。

2、實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清；PBS緩沖液；RNA酶抑制劑；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；qPCR混合液；β-actin引物。

3、細(xì)胞樣本：人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系。

（二）移液器性能基礎(chǔ)驗(yàn)證

1、移液精度與重復(fù)性檢測(cè)

參照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，選取3個(gè)關(guān)鍵量程（1μL、10μL、100μL），采用去離子水為樣品，在25℃、濕度50%環(huán)境下，每個(gè)量程重復(fù)移液10次，通過(guò)電子天平稱重計(jì)算實(shí)際移液體積，統(tǒng)計(jì)均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）及變異系數(shù)（CV），驗(yàn)證精度（實(shí)際體積與設(shè)定體積偏差）和重復(fù)性（CV值）。同時(shí)以某品牌移液器作為對(duì)照。

2、液體殘留檢測(cè)

選取10μL量程，移取0.1%亞甲基藍(lán)溶液，將液體完全排出后，用50μL無(wú)水乙醇沖洗吸頭內(nèi)部，通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)沖洗液中染料吸光度，計(jì)算殘留率。

（三）單細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)

1、細(xì)胞預(yù)處理

MCF-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化后用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?cells/mL，經(jīng)40μm細(xì)胞篩過(guò)濾去除聚集體。

2、單細(xì)胞分選與捕獲

采用流式細(xì)胞分選儀標(biāo)記CD44?目標(biāo)細(xì)胞，通過(guò)博清生物單道移液器（10μL量程）將分選后的單細(xì)胞逐一轉(zhuǎn)移至96孔板（每孔含10μL含RNA酶抑制劑的裂解液）。操作過(guò)程中控制吸液速度為2檔、排液速度為1檔，避免液體飛濺。同時(shí)使用對(duì)照移液器進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔計(jì)數(shù)目標(biāo)細(xì)胞捕獲數(shù)量，計(jì)算捕獲成功率。

（四）微量RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

采用微量核酸提取試劑盒對(duì)捕獲的單細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，全程使用博清生物單道移液器（1-10μL量程）進(jìn)行試劑添加、液體轉(zhuǎn)移等操作。提取完成后，通過(guò)生物分析儀檢測(cè)RNA完整性數(shù)（RIN），并采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280比值（1.8-2.0為合格）。

（五）qPCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1、cDNA合成

取1μL單細(xì)胞RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系總體積10μL，使用博清生物單道移液器精準(zhǔn)添加引物、酶、緩沖液等試劑，反應(yīng)條件：25℃ 10min，50℃ 30min，85℃ 5min。

2、qPCR擴(kuò)增

以β-actin為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異性引物。qPCR反應(yīng)體系20μL，其中cDNA模板2μL，使用博清生物單道移液器精準(zhǔn)分配反應(yīng)液至384孔板，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。擴(kuò)增條件：95℃ 10min，隨后95℃ 15s、60℃ 1min，40個(gè)循環(huán)。記錄Ct值，計(jì)算變異系數(shù)。

二、結(jié)果

（一）移液器基礎(chǔ)性能驗(yàn)證結(jié)果

博清生物單道移液器在不同量程下的移液精度與重復(fù)性均表現(xiàn)優(yōu)異，且顯著優(yōu)于對(duì)照移液器（P<0.05）。1μL量程下，博清移液器實(shí)際移液體積均值為0.98±0.01μL，CV值為0.82%，而對(duì)照移液器實(shí)際體積為0.92±0.03μL，CV值為3.26%；10μL和100μL量程下，博清生物移液器CV值分別為0.57%和0.31%，均低于對(duì)照移液器。液體殘留檢測(cè)顯示，博清生物移液器殘留率為0.32%±0.05%，顯著低于對(duì)照移液器的1.21%±0.13%（P<0.01）。

（二）單細(xì)胞捕獲成功率

博清生物單道移液器組的單細(xì)胞捕獲成功率為92.3%±2.1%，顯著高于對(duì)照移液器組的81.7%±3.5%（t=4.62，P<0.01）。鏡檢結(jié)果顯示，博清生物移液器組96孔板中單個(gè)細(xì)胞孔占比達(dá)90.5%，無(wú)細(xì)胞孔占比6.3%，多細(xì)胞孔占比3.2%；而對(duì)照移液器組單個(gè)細(xì)胞孔占比78.1%，無(wú)細(xì)胞孔占比12.5%，多細(xì)胞孔占比9.4%。

（三）RNA提取質(zhì)量

博清移液器組提取的單細(xì)胞RNA樣本RIN均值為8.6±0.3，A260/A280比值為1.92±0.05，均滿足scRNA-seq建庫(kù)對(duì)RNA質(zhì)量的要求（RIN≥7.0）；對(duì)照移液器組RIN均值為7.8±0.5，A260/A280比值為1.85±0.08，兩組RIN值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.87，P<0.05）。

（四）qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

博清生物移液器組β-actin基因Ct值為28.3±0.4，CV值為1.41%；對(duì)照移液器組Ct值為29.1±0.8，CV值為2.75%。兩組Ct值CV值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.95，P<0.05），表明博清生物移液器組實(shí)驗(yàn)重復(fù)性更優(yōu)。

三、討論

單細(xì)胞研究的核心挑戰(zhàn)之一是如何在微量操作中維持細(xì)胞完整性與核酸穩(wěn)定性，而移液器的性能直接決定了實(shí)驗(yàn)流程的可控性。本研究針對(duì)博清生物單道移液器的核心性能及在單細(xì)胞研究中的應(yīng)用場(chǎng)景進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證，結(jié)果表明該儀器在多個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)上表現(xiàn)突出。

在基礎(chǔ)性能方面，博清生物單道移液器通過(guò)優(yōu)化活塞結(jié)構(gòu)與密封技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了全量程范圍內(nèi)的高精準(zhǔn)度與強(qiáng)重復(fù)性，1μL微量移液時(shí)CV值僅0.82%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)移液器，這一優(yōu)勢(shì)在單細(xì)胞分離等需要精準(zhǔn)轉(zhuǎn)移微量液體的場(chǎng)景中尤為重要。液體殘留率低（0.32%）的特點(diǎn)可減少試劑浪費(fèi)與交叉污染，降低后續(xù)核酸檢測(cè)的背景干擾，這與該儀器采用的防殘留吸頭適配設(shè)計(jì)密切相關(guān)。

在單細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)中，博清生物移液器92.3%的捕獲成功率顯著高于對(duì)照儀器，這得益于其平穩(wěn)的吸液/排液控制與精準(zhǔn)的量程校準(zhǔn)。單細(xì)胞分離過(guò)程中，吸液速度過(guò)快易導(dǎo)致細(xì)胞損傷，排液不完全則會(huì)造成細(xì)胞丟失，而博清生物移液器的多檔速度調(diào)節(jié)功能與高密封性能有效解決了這一問(wèn)題，減少了無(wú)細(xì)胞孔和多細(xì)胞孔的比例，為后續(xù)單細(xì)胞分析提供了高質(zhì)量的樣品基礎(chǔ)。

RNA質(zhì)量是單細(xì)胞測(cè)序成功的關(guān)鍵，本研究中博清生物移液器組提取的RNA RIN均值達(dá)8.6，表明其在微量試劑添加、液體轉(zhuǎn)移過(guò)程中能有效保護(hù)RNA完整性，避免因操作不當(dāng)導(dǎo)致的核酸降解。這一結(jié)果與該儀器的低液體殘留特性相關(guān)，減少了RNA酶污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)精準(zhǔn)的移液操作確保了提取試劑比例的準(zhǔn)確性，提升了核酸提取效率。

qPCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，博清生物移液器組Ct值CV值僅1.41%，體現(xiàn)了其在高通量檢測(cè)中的優(yōu)異重復(fù)性。在單細(xì)胞qPCR等對(duì)反應(yīng)體系均一性要求極高的實(shí)驗(yàn)中，移液偏差會(huì)導(dǎo)致Ct值離散度增大，影響基因表達(dá)定量的可靠性，而博清生物移液器的高重復(fù)性可有效降低實(shí)驗(yàn)誤差，提升數(shù)據(jù)可信度。

綜上，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的單道移液器通過(guò)在精準(zhǔn)度、重復(fù)性、防殘留等方面的技術(shù)優(yōu)化，能夠完美適配單細(xì)胞研究中的微量操作需求，從單細(xì)胞分離、核酸提取到后續(xù)檢測(cè)的全流程提供穩(wěn)定支撐。與傳統(tǒng)移液器相比，其在提升實(shí)驗(yàn)效率、保障數(shù)據(jù)質(zhì)量方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，有望成為單細(xì)胞生物學(xué)、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的理想實(shí)驗(yàn)工具。

本研究系統(tǒng)驗(yàn)證了博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的單道移液器在單細(xì)胞研究中的應(yīng)用性能，證實(shí)該儀器具有高移液精度、強(qiáng)重復(fù)性、低液體殘留等核心優(yōu)勢(shì)，可有效提升單細(xì)胞捕獲成功率、保障RNA完整性及qPCR檢測(cè)重復(fù)性，滿足單細(xì)胞分離、微量核酸分析等關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)的技術(shù)要求。博清生物單道移液器憑借其優(yōu)異的性能與良好的操作適配性，為單細(xì)胞研究提供了穩(wěn)定可靠的工具支持，具有廣闊的科研應(yīng)用前景。